2016年NgAgo技术的问世曾搅乱基因编辑的一湖池水，并掀起了惊涛骇浪而后续又饱受争议。那么NgAgo技术到底如何，南通大学刘东教授于2016年11月发表于CellRes杂志的一篇文章《NgAgo-basedfabp11ageneknockdowncauseseyedevelopmentaldefectsinzebrafish》似乎将笼罩于NgAgo技术的浓雾吹散了一些。

　　前几日刘教授在基因编辑学术研讨会上也以基于NgAgo技术敲低斑马鱼基因表达为题，做了细致的研究报道。

　　南通大学神经再生重点实验室刘东教授

　　刘东教授在NgAgo技术发现之初，确实是想利用该技术进行基因敲除。但是随着实验的开展，他想要完成的基因敲除（knockout）并没有实现，却意外收获了基因敲低（knockdown）这一结果。

　　基因敲除与敲低，虽然只有一字之差，但却是两个完全不同的学术概念。基因敲除是去掉不想要的基因，使目标基因永久性地表达沉默；而基因敲低则保留目标基因，只是阻断目标基因的表达，但在下一代生物体内依然能够进行基因表达。敲除是基因编辑的功能之一，而敲低则不是。

　　为了探索靶基因Fabp11a（脂肪酸结合蛋白11a，在调解葡萄糖和脂代谢稳态方面起着重要作用）对斑马鱼胚胎发育中的生物功能，设计了针对该基因的两条5'-磷酸化的ssDNA，并将其与优化过的NgAgo-2nlsmRNA一起注射到1细胞期的胚胎中。

　　另外，为了确保注射的NgAgomRNA能进入细胞核中表达NgAgo蛋白，研究者还专门在mRNA的两端增加了核内定位序列（NLS），而5’-磷酸化单链DNA专门靶向fabp11a的第二和第三个外显子——如果NgAgo能编辑基因，这两段基因序列会被改变。

　　结果发现，注射过的胚胎中约有30%会在发育后出现两种眼部畸形的表型：眼部有一只相对小一点的眼睛而另一只显得十分小；或者两只眼睛融合形成一只较大的眼睛。

　　尽管该表型发生了变化，但是在抽提斑马鱼胚胎（正常/突变型）DNA并对靶基因进行扩增测序后，发现靶基因没有任何基因突变，但通过RT-PCR检测靶基因表达却有显著敲低。因而，刘东团队认为NgAgo系统确能导致斑马鱼表型改变（眼部发育缺陷），但是与靶基因的编辑无关，反是通过靶基因的敲减（knockdown）来行使功能。

　　此外，为了确认gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中敲低基因是一种普遍的现象，也测试斑马鱼中的其他四个基因（ta、kdrl、lama1和flt1）。以基因ta（决定斑马鱼有无尾巴性状）为例，研究结果发现约有30%注射过的胚胎出现没有尾巴的表型，这也证明了NgAgo技术的knockdown作用是具有普遍性的。

　　无独有偶，韩国科学家Jin-SooKim发表于论文预印本网站BioRxiv的文章《DNA-dependentRNAcleavagebytheNatronobacteriumgregoryiArgonaute》也认为NgAgo系统切割的是RNA，而不是DNA。

　　韩国研究者发现NgAgo蛋白具有DNA依赖的RNA酶活性（依赖于二价金属离子），且与NgAgo结合的DNA（gODNs）序列必须与RNA反向互补，而正义DNA（senseDNA）序列则不能引导NgAgo切割靶RNA。即当与NgAgo结合的DNA序列如果与RNA序列相同，则不能引导NgAgo切割靶RNA。

　　他们还发现gODNs的长度和序列会对NgAgo切割RNA效率产生影响。当gODNs长度低于13个核苷酸（nt）则完全不能介导NgAgo的RNA酶活性，而碱基错配会影响NgAgo的酶活性，尤其是第5-14nt（5’-3’方向）的碱基最为关键。因而，Kim的文章也从侧面呼应了在斑马鱼体内的实验结果。

　　而至于DNA序列对NgAgo系统的影响，刘东教授认为Kim的研究结果只能解释gODNs与RNA反向互补的情况。他指出即使NgAgo介导的DNA与mRNA的序列相同，也是存在基因下调活性的，只是活性比较低。但这与Kim等人的发现并不矛盾，他推测这可能是因为DNA介导的NgAgo还会与靶基因结合，抑制了目标DNA的转录造成的。

　　因而，相比于传统方法，NgAgo技术其敲低效率是比较高的，可作为RNAi以外的另一种基因敲低（knockdown）工具来使用。而且即便如此，关于NgAgo技术仍有一些有趣的东西没有研究清楚，需要进一步的探索。

　　以上则是刘东教授关于NgAgo技术研究的后续研究工作，同样他也希望能与其他研究团队合作一起挖掘并推动对NgAgo和其它该家族蛋白的新的兴趣点。