小小身体蕴含大大能量！前列腺癌非侵入性的诊断和监测的新方式——胞外囊泡（外泌体）代谢组学！目前，胞外囊泡/外泌体作为非侵入性的癌生物标志物已成为新的研究热点。芬兰赫尔辛基大学学者Maija Puhka在期刊 Theranostics（IF=8.85）上发表了相关文章，下面我们一起来看看吧！

作者：Maija Puhka  芬兰 赫尔辛基大学

期刊：Theranostics

影响因子：8.85

研究背景

胞外囊泡（EVs）是一种很有前景的生物标志物来源。近些年来研究的热点-外泌体就是一种直径在40-100nm的盘状囊泡，在许多研究，特别是针对癌症的研究，都集中在EVs的RNA和蛋白质载体上，其中有一些EVs来源的癌症生物标志物已经在临床上使用，除此之外，在脂质、DNA和糖蛋白分析方面也有新的进展。

由于癌细胞会比正常细胞分泌更多的囊泡，因此通过研究体液中EVs代谢物的含量变化可以提供一种检测癌症动态相关生物标志物的方法，EVs在前列腺癌和其他癌细胞的代谢控制中起到了重要的作用。本文研究了尿液和血小板EVs中的小分子代谢物水平，并采用不同的归一化方法，分析比较了前列腺切除前后前列腺癌（Pca）患者和健康对照组的尿液EVs（UEVs）样本。

研究方法

1. 采用靶向超高效液相色谱法质谱联用技术（UPLC-MS），分析原始尿样、血小板及其分离的EVs中的一百多种代谢物。

2. 确定了EVs富集的代谢产物后通过数据库搜索分析其亚细胞来源、途径和相关酶或转运蛋白。

3. 比较了前列腺切除前后前列腺癌（Pca）患者和健康对照组的尿液EVs（UEVs）样本，检测EVs及尿液来源因子及代谢物间比率，以确定组学数据的归一化分析方法。

研究结果

1. 对EVs的分离及验证

采用差速离心的方法对尿液或血小板浓缩物分离得到EVs样品，并利用EM（电子显微镜）、Western blotting（蛋白免疫印迹）和NTA（纳米粒子跟踪分析）对分离得到的EVs样品进行了验证，EM观察到的大多数UEVs具有单个膜的球状体，同时也发现一些多膜层EVs；WB表明UEVs中无细胞碎片，用NTA测定的单个样品中，UEVs的尺寸分布变化不明显。综上表明：分离得到的EVs样品中有足够纯度的EVs。

图1.EV样品的分离验证

（A. EM显示UEVs典型的圆形形态和大小范围；B.偶尔见到多膜层的UEVs；C-D.EVs标志物CD59和CD63的免疫标记显示；E. EM图像中UEVs的大小分布表明；F. 经EM观察，血小板EVs(PEVs)具有典型的形态特征；G.UEVs分离的WB验证。）

图2. 应用WB法和NTA法对UEVs样品进行代谢组学表征

（A. 用EVs标记物对UEVs样本进行Western blotting；B. UEVs浓度的NTA分析；C.UEVs的尺寸分布）

2. 靶向代谢组检测所需最低EVs量的确定

在检测过程中发现，对于1×109EVs，大多数代谢物仍低于检测限，在分析1010EVs时，结果显示大多数代谢物高于检测限。在UEVs样本中，102种代谢物中有40-82种（39-80%）高于检出限，32-55种（31-54%）高于定量限，在PEVs样品中，111种代谢物中有62种（56%）被检出，41种（37%）高于定量限。

3. 尿液、血小板EVs中主要代谢产物类别、途径及其浓度

EVs中常见的代谢物可以分为五类：1）有机酸及其衍生物，2）核苷酸、糖和衍生物，3）肉碱，4）维生素B/相关代谢物，5）胺。分别分析了所有UEVs或PEVs中被定量的化合物，进行了代谢物富集分析，并使用代谢物摩尔质量除以EVs总体积以计算EVs中代谢物的浓度。结果表明：不同来源的EVs代谢谱具有相似性，但是也表现出明显的差异，EVs中含有能够富集到多种通路的物质，且其中某些物质具有较高浓度。

图3. UEV和PEV中代谢物含量及途径的比较

（A.UEVs和PEVs中高于定量限的代谢物韦恩图分析；B.代谢物富集分析）

4. 尿液、血小板EVs代谢物的重叠及差异

尿液、血小板及其分离EVs中的代谢产物存在重叠，但也存在各自特有的代谢产物。在所有尿液样本中，83个高于检测限的代谢物中，有36个（43%）在所有对照UEVs样本中被检测到，在所有血小板样本中检测到的51种代谢物中，有47种（92%）也在所有PEVs中检测到。结果表明：分离的EVs和对应的来源样本中的代谢物谱是有重叠的，但在定性和定量上却有明显差异，这表明我们成功地纯化了EVs，并对其EVs内代谢物进行了分析。

图4. EVs中代谢物含量与其来源的韦恩图比较

5. EVs中特定代谢物与已报道的EVs中存在的酶和转运蛋白有较好的相关

确定EVs富含的代谢产物后通过数据库分析其亚细胞来源。结果表明：EVs丰富了一系列细胞溶质代谢物，其中包括核苷酸和亚精胺途径的产物，这些产物与许多EVs驻留酶和转运蛋白相关。

图5. EVs代谢物的亚细胞定位

6. 采用不同的归一化方法比较前列腺癌中EVs代谢物含量的变化

对前列腺癌患者手术前后及健康人的尿液EVs进行了比较，并利用EVs的体积、数量和CD9光密度对数据进行归一化，得到了相似的结果。结果表明：前列腺癌患者的腺苷、葡萄糖醛酸盐、异丁酰-L-肉碱和D-核糖5-磷酸含量均低于健康对照组和前列腺切除后尿液样品的2-26倍（P＜0.05），这些变化仅能在EVs来源的因子或与代谢物的比值中被发现，在原尿样品中则不存在，与EVs来源因子和代谢物比率归一化相比，尿量或肌酐归一化没有显著差别，说明对EVs衍生因子的归一化或代谢物比率的分析最有可能揭示EVs代谢物谱中与癌症相关的变化。

图6. 前列腺癌中UEVs中代谢物显著变化

（A.将单个UEVs中代谢物浓度归一化为CD9的OD值；B. 两种代谢物之间的比率表明在前列腺切除术前的样本中代谢物的变化）

结论

研究表明：不同来源样本的EVs代谢物分析可以采用高通量的平台，而且仅需要相对少量的样品材料。通过代谢物的特异性富集及归一化方法的应用，利用EVs代谢组学其代谢产物可以通过不分析原始的EVs来源物质，而直接获得新的生物标志物。EVs代谢组学可以提供一种新的非侵入性和高通量工具，用来监测前列腺癌或其他疾病。

原创： Jack Biotree代谢组学