文章题目为Strategy for Global Profiling and Identification of 2-and 3-Hydroxy Fatty Acids in Plasma by UPLC-MS/MS ，是由中国医学科学院药物研究所的再帕尔教授课题组近期发表在Analytical Chemistry上的一篇文章。

研究背景

脂肪酸是体内一类重要的脂类成分，参与机体众多代谢过程，包括细胞凋亡，信号转导、胰岛素抵抗以及能量代谢等。除了大多数的直链脂肪酸外，还有一些脂肪酸的衍生物（包括支链脂肪酸、羟基脂肪酸等）在生物体的代谢过程中也发挥着重要作用。本研究中，作者的关注点就集中在羟基脂肪酸上，这类化合物与脂肪酸的氧化有密切联系。

羟基脂肪酸（OHFA）的分类：最常见的形式为2-羟基脂肪酸（2-OHFAs）和3-羟基脂肪酸（3-OHFAs）两类。尽管这类化合物在机体中发挥重要作用，但是由于其在体内浓度较低，在分析时通常会被忽略。

检测方法：

基于质谱的鸟枪法：通过对C=C双键或者羧基进行衍生，达到区分异构体的目的，但是脂质提取物直接注入带来的离子抑制作用影响了低浓度脂肪酸的检测。

气质联用：通常需要对样本进行甲酯化，但是衍生化的操作费时费力，还会引入multi-origination和multipeak 现象，进而影响定量分析的准确性。

液质联用：拥有高灵敏度和高选择性，已建立了一些方法用于羟基脂肪酸的检测，但是由于标准品的缺乏，这些方法只关注了一小部分2-OHFAs或3-OHFAs。

目前还没有一个方法能够同时对2-OHFAs和3-OHFAs进行检测，本研究就将使用LC-MS/MS技术建立方法，同时对生物样本中的2-OHFAs和3-OHFAs进行全面检测分析。

实验流程：

分析2-OHFAs和3-OHFAs的串联质谱图，寻找特征离子，建立包含母离子信息和子离子信息的理论数据库；

使用LC-Orbitrap MS分析血浆样本，用上述数据库对样本中的2-OHFAs和3-OHFAs化合物进行归属（通过对比其他脂肪酸类异构体的特征碎片离子，可以避免归属信息错误）；

根据碳链长度，C = C双键数和羟基位置，构建与结构有关的保留行为预测模型，从而进一步证实OHFA的结构；

采用留一法进行交叉验证法对模型预测的稳健性和预测准确性进行评估；

方法建立完成，用于食管鳞状细胞癌患者（ESCC）血浆样本检测，发现生物标记物 。

实验结果：

样本提取方法：

对多种溶剂系统提取效果进行比对，最后选择使用的提取方法为1μL血浆+300μL甲醇+800μL MTBE

2-OHFAs和3-OHFAs类物质的色谱分离

使用20种标准品来优化LC-MS/MS方法，如图所示，标准品得到很好分离。从图中可以发现在反相色谱中1. 3-OHFAs的出峰时间比起对应的2-OHFAs异构体出峰时间早；2. 两类物质的保留时间随着碳链长度的增加而增加，随着双键数的减少而增加。

总结碎片离子规律，建立数据库

碎片规律：

2-OHFAs产生46.0049Da中性丢失；3-OHFAs通过麦氏重排产生碎片离子m/z 59.0138

基于上述规律，可以从理论上计算2-OHFAs和3-OHFAs类物质的碎片离子，通过计算，最终建立了一个in-house数据库，包含碳原子数（4-26），C=C双键数（不饱和度0-6），以及对应物质的母离子和子离子信息。

在血浆样本进行检测时，如果一个峰的质荷比与数据库中记录的数值偏差小于10ppm，那么这个峰将被添加至inclusion list中在PRM模式下获取串联质谱信息。

如果串联质谱信息与数据库中记录的特征离子相匹配，那么该物质将被作为2-OHFAs和3-OHFAs候选离子。上图显示的就是血浆样本中不饱和度为0和1的2-OHFAs和3-OHFAs物质，蓝色表示已经经过标准品比对，红色表示在HMDB数据库中还没有记载的新发现的羟基脂肪酸。

避免错误归属：

46.0049Da中性丢失和碎片离子m/z 59.0138并不是2-OHFAs和3-OHFAs的专属特征信号，很多n-OHFAs或者环氧脂肪酸也具有这些特征。通过文献检索，可对羟基脂肪酸的碎片离子做如下总结：

对于羟基脂肪酸类物质来说， 碎片离子m/z 59.0138是3-OHFAs的特有离子，但是其对应的环氧或者环酮类异构体也可以产生此碎片。由于这类环氧或环酮官能团通常出现在脂肪链的中间位置，所以他们出来有m/z 59.0138碎片离子外，还有其他丰富的碎片离子。

2-OHFAs和ω-OHFAs（末端羟基脂肪酸）都可以产生46.0049 Da中性丢失作为主要碎片离子；其他羟基脂肪酸也可以产生该中性丢失，但是通常会同时产生其他的碎片离子。因此，2-OHFAs和ω-OHFAs可以通过碎片离子与其他羟基脂肪酸类物质进行区分。

羟基位置的不同，会导致色谱行为的差异，有报道显示在反相色谱中ω-OHFAs比其对应的 2-OHFAs异构体出峰时间早，可以帮助我们区分 2-OHFAs和ω-OHFAs。

所以，要想区分羟基脂肪酸类物质，需要综合考虑保留时间和碎片信息。

构建与结构相关的保留时间预测模型

要想确定2-OHFAs和3-OHFAs的结构，仅依靠一级质谱和串联质谱信息是不够的，而且之前总结的碎片离子并不是此类物质所特有，所以保留时间也是需要考虑的信息。OHFA的保留行为与其化学结构（包括羟基位置、碳链长度、C=C双键数）有密切联系。对于具有相同不饱和度的2-OHFAs和3-OHFAs来说，其保留时间随着碳原子数的增加呈线性增加。

以3-OHFAs为例，此类物质的保留时间与碳原子数呈线性相关，相关系数为0.9933，使用该相关方程对六个物质进行预测，其结果与化学标准比对证实准确。

考察了保留时间与不饱和度之间的相关性，结果显示C=C双键数与保留时间呈线性负相关。

建立3D-模型用于不饱和3-OHFAs鉴定，3D图中直观地显示了保留时间与其碳链结构的关系。

最终使用上述模型，在血浆中检测到了32个3-OHFAs，其中20个为最新报道的物质。

同样的，2-OHFAs也建立了相同的预测模型。需要注意的是，大多数的2-OHFAs候选物质都是饱和的，只有少数几个物质含有C=C双键，而且只有1个不饱和的2-OHFAs标准品，所以没有办法构建2-OHFAs不饱和度与保留时间的预测模型。但是，2-OHFAs的保留时间与其对应的3-OHFAs异构体的保留时间呈现很好的线性相关，相关系数R2=0.9999（图5B），所以我们可以通过对应的3-OHFAs的保留时间推测2-OHFAs的保留时间，作者使用FA（18:1）-2OH标准品来验证预测的准确性。

最终使用上述模型方法，作者鉴定了18个2-OHFAs，其中7个为新报道物质。

方法应用：

检测ESCC患者和健康人血浆样本中的2-OHFAs和3-OHFAs信息，寻找生物标记物，用于探究该类羟基脂肪酸在疾病过程中的变化。最后发现6个羟基脂肪酸类物质在ESCC患者中发生明显改变，标明其与疾病的发生发展密切相关。

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